Netopiere žijú všade okrem Antarktídy a Arktídy a niekoľkých oceánskych ostrovov (na sever po hranicu stromov). Najhojnejšie sú v subtropických a tropických pásmach.
Netopiere sú nočné živočíchy, deň prespia v nejakom úkryte, večer alebo v noci odtiaľ vyletujú. Lietajú potichu, pričom permanentne mávajú krídlami.
Sú to hmyzožravce, ale niektoré kaloňoblížne jedia aj plody a ryby, a niektoré cicajú krv väčších cicavcov.
Úkryty sa môžu vyskytovať kdekoľvek, aj v mestách a obciach vo vežiach a podobne a v solitérnych budovách. Veľa druhov sa ukrýva v podzemných dutinách, jaskyniach, starých štôlňach či bútľavých stromoch.
V strednej Európe netopiere vyhľadávajú teplejšie jaskyne, pivnice a podobne, kde upadajú do zimného spánku (hibernácia). Ich teplota sa veľmi zníži (vždy na teplotu úkrytu), telesné funkcie sa tým spomalia a spotrebúvajú tukové zásoby v tele. Do tepelne vhodných úkrytov sa niektoré druhy zlietajú až zo vzdialenosti vyše 100 km.
Netopiere žijú často v kolóniách (niekedy samice a samce oddelene), ktoré potom nájdeme v jaskyniach. Oddychujú tak, že visia dolu hlavou zakvačené ostrými pazúrmi zadných nôh na hrbolčeky skál (niektoré druhy sa navyše zakrútia do blanitých krídel).
Najvyvinutejšie zmysly sú hmat a sluch, ďalej čuch; oči sú spravidla zakrpatené. Ušnice sú rozlične dlhé, u niektorých druhov veľmi dlhé, napríklad u ucháča či ucháňa. Pre netopiere okrem kaloňoblížnych je charakteristická echolokácia, čiže sa v tme orientujú pomocou odrazu nimi vyslaných vysokofrekvenčných zvukov. Zvuky (tzv. kliky) vznikajú v hrtane, vysielajú sa cez nos alebo ústa a sú usmerňované alebo zameriavané nosovým listom (ak je prítomný). Ozvenu zvuku zachytia uši. Vzdialenosť predmetu určujú podľa času návratu zvuku.